摘要：以紫紅曲霉、葡萄牙棒孢酵母、己酸菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象復(fù)配一種多菌種酯化酶，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選出酯化力最高的配比方案：紫紅曲霉菌種60%，葡萄牙棒孢酵母20%，己酸菌菌種20%。以此配比制作的麩曲與大曲按比例投入到濃香型白酒的生產(chǎn)中，考察不同曲用量比例的實(shí)驗(yàn)窖池，對(duì)其出酒率、原酒的理化指標(biāo)和感官質(zhì)量進(jìn)行綜合分析，得到最優(yōu)的曲用量比例：大曲21.5%、復(fù)合酯化酶菌種麩曲1.5%。

關(guān)鍵詞：酯化酶；紫紅曲霉；葡萄牙棒孢酵母；己酸菌；正交實(shí)驗(yàn)；濃香型白酒

青島瑯琊臺(tái)集團(tuán)股份有限公司 徐宗喜 趙詠偉 晁進(jìn)福 徐廣祥 辛躍強(qiáng) 柳邦向 陳燊君

白酒是我國(guó)傳統(tǒng)的蒸餾酒，擁有數(shù)千年的釀造歷史，也是中華文明的重要組成部分。在感官上，國(guó)外蒸餾酒以醇香為主，中國(guó)白酒則是以酯香為主，其中，濃香型白酒的主體呈香物質(zhì)是己酸乙酯，其含量及與其他乙酯的量比關(guān)系決定了濃香型白酒的品質(zhì)和風(fēng)格¹。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐和研究表明，濃香型白酒中己酸乙酯和乳酸乙酯比例控制在1∶（0.5-0.8）²，能使主體香突出，香、味協(xié)調(diào)，酒體典型性強(qiáng)。然而目前，濃香型白酒企業(yè)多存在原酒中己酸乙酯含量不足、乳酸乙酯含量偏高的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了白酒的品質(zhì)。因此，增己降乳成為提高濃香型白酒品質(zhì)的重要課題。

目前，增己降乳的研究比較多，主要技術(shù)措施有³-[5]：己酸菌與其他菌種混合培養(yǎng)、回酒發(fā)酵、雙輪底發(fā)酵、酯化酶增香技術(shù)、復(fù)合酯化酶生態(tài)菌劑的應(yīng)用等。其中，紫紅曲霉、葡萄牙棒孢酵母以及己酸菌對(duì)提升濃香型白酒中的己酸乙酯含量具有非常積極的作用，并且混合菌劑中的微生物相互作用可以激發(fā)更高的生物活性和酯化能力。所以，本文以紫紅曲霉、葡萄牙棒孢酵母、己酸菌為研究對(duì)象，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)找到三種菌種最佳復(fù)配比例，制作一種高酯化力的復(fù)合菌劑，并應(yīng)用到濃香型白酒的生產(chǎn)中，以期提高原酒的出酒率和品質(zhì)。

1.材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種與大曲

紫紅曲霉、葡萄牙棒孢酵母、己酸菌、大曲。

1.1.2主要試劑

葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、瓊脂粉、乙酸鈉、硝酸鈉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸亞鐵、碳酸鈣、氫氧化鈉、鹽酸、酚酞試劑、乙醇、乳酸、酵母浸粉、酵母膏。

1.1.3培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，自然pH；

乙酸鈉培養(yǎng)基：乙酸鈉0.5%、酵母膏0.1%、硫酸鎂0.02%、磷酸氫二鉀0.04%、硫酸銨0.05%、碳酸鈣1%、乙醇2%（培養(yǎng)基滅菌后再添加）、pH6.5、瓊脂粉1.5%～2%；

查氏培養(yǎng)基：蔗糖3%、硝酸鈉0.3%、磷酸氫二鉀0.1%、氯化鉀0.05%、硫酸鎂0.05%、硫酸亞鐵0.001%、pH7.2-7.4、瓊脂粉1.5%。

1.2主要儀器與設(shè)備

滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫震蕩搖床、恒溫培養(yǎng)箱、ISO-9001電子分析天平、CJPF-J30酒精計(jì)、Agilent7890B氣色譜儀、電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌種活化

1.3.1.1葡萄牙棒孢酵母菌種活化

將葡萄牙棒孢酵母凍干粉接種至10mL YPD液體培養(yǎng)基中，200r/min 30℃培養(yǎng)12h后，涂布平板，30℃培養(yǎng)48h后，再挑取單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，鏡檢，選擇細(xì)胞個(gè)體均勻的單菌落進(jìn)行活化培養(yǎng)。

1.3.1.2己酸菌菌種活化

取甘油管保藏己酸菌1支，接種至20mL試管培養(yǎng)基中，35℃厭氧培養(yǎng)6天，在乙酸鈉固體培養(yǎng)基中涂平板，37℃培養(yǎng)7d后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。將活化好的己酸菌以10%的接種量依次接種至100mL液體培養(yǎng)基、1L液體培養(yǎng)基、3L液體培養(yǎng)基、20L卡氏罐中，35℃厭氧各培養(yǎng)6天。

1.3.1.3紫紅曲霉菌種活化

取斜面保藏的紫紅曲霉，接種至10mL查氏液體培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)48h，在固體培養(yǎng)基中涂平板，32℃培養(yǎng)5d后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，鏡檢，選擇菌落大小均勻的單菌落依次接種至10mL、100mL液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)。

1.3.2復(fù)合酯化酶菌種的優(yōu)化

利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將紫紅曲霉、葡萄牙棒孢酵母、己酸菌三種菌種按不同比例接種到麥麩培養(yǎng)基中，制作成多菌種酯化酶麩曲，以酯化力大小作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，獲得最優(yōu)配比。

1.3.2.1正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

確定紫紅曲霉菌種比例（A）、葡萄牙棒孢酵母菌種比例（B）、己酸菌菌種比例（C），按L_9（3）^3表進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平表見表1。

1.3.2.2多菌種酯化酶麩曲制作工藝見圖1

1.3.2.3酯化力的測(cè)定方法

稱取5g干曲的曲量，加入100mL含3%己酸、5%vol乙醇的酯化體系中,30℃酯化100h，加水50mL蒸餾，接餾出液100mL，最后用氣相色譜檢測(cè)反應(yīng)體系中形成的己酸乙酯含量。酯化力定義為每100mL餾出液中含己酸乙酯毫克數(shù)。數(shù)值最大者即為實(shí)驗(yàn)中的最佳菌種配比方案，以此菌種配比方案制作的麩曲繼續(xù)后續(xù)大生產(chǎn)應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。

1.3.3復(fù)合酯化酶菌種麩曲與大曲在濃香型白酒生產(chǎn)中配比的優(yōu)化

利用前期實(shí)驗(yàn)中酯化力最高的菌種配比方案制得的麩曲與大曲，按不同比例投入酒醅入池發(fā)酵，其他釀造條件保持一致。配比方案見表2。

2.結(jié)果與分析

2.1正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

按L_9（3）^3設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析可知：（1）對(duì)酯化力影響的因素依次為A＞C＞B，說(shuō)明紫紅曲霉在復(fù)合菌系中是優(yōu)勢(shì)菌種，其酯化力最強(qiáng)以及其比例大小對(duì)復(fù)合菌種的酯化力影響最大；（2）最優(yōu)組合是A3B2C2，即本實(shí)驗(yàn)的多菌種酯化酶的最優(yōu)配比為紫紅曲霉菌種60%，葡萄牙棒孢酵母菌種20%，己酸菌菌種20%。

2.2實(shí)驗(yàn)窖池原酒的主要理化指標(biāo)、出酒率及感官評(píng)價(jià)結(jié)果分析

統(tǒng)計(jì)三輪實(shí)驗(yàn)窖池的出酒率、理化指標(biāo)、感官品評(píng)結(jié)果見表3。

由表3可知：（1）與方案一（對(duì)照組）相比，實(shí)驗(yàn)組的原酒主要風(fēng)味成分隨著復(fù)合酯化酶菌種麩曲使用比例的提高而提高。不過(guò)，當(dāng)麩曲使用量超過(guò)2%時(shí)，己酸乙酯含量有所下降，并且乙酸乙酯的含量過(guò)高，原因可能是復(fù)合菌種對(duì)乳酸菌具有抑制作用并對(duì)乙酸乙酯的合成也具有積極作用；（2）感官評(píng)價(jià)得分大小順序?yàn)榉桨?＞方案3＞方案2＞方案5＞方案1，即原酒品質(zhì)隨著復(fù)合酯化酶菌種麩曲使用比例的提高而提高，但當(dāng)麩曲使用量超過(guò)2%時(shí)，酒質(zhì)會(huì)下降。所以，結(jié)合出酒率和感官評(píng)價(jià)得分可知，最優(yōu)曲用量配比為大曲21.5%和麩曲1.5%。

3.結(jié)論

通過(guò)優(yōu)化酯化酶功能菌種的配比，能夠有效提升復(fù)合菌種的生物活性和酯化力。

濃香型白酒的生產(chǎn)過(guò)程是多菌種相互作用且開放式的復(fù)雜發(fā)酵體系，數(shù)量難以控制，量比關(guān)系不固定等缺陷使得酒質(zhì)不穩(wěn)定。而多菌種酯化酶由于是人為控制合成的生態(tài)菌劑，主要功能微生物數(shù)量足、功能強(qiáng)、量比關(guān)系穩(wěn)定，能夠彌補(bǔ)生產(chǎn)中的不足，突出了己酸乙酯的主體香，使得酒體豐滿協(xié)調(diào)，提高了原酒的質(zhì)量。

多菌種酯化酶在濃香型白酒生產(chǎn)中的使用量并非越多越好，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其使用量超過(guò)2%時(shí)，原酒中的乙酸乙酯含量過(guò)高，導(dǎo)致主體香不突出，酒體淡薄，酒質(zhì)下降。

參考文獻(xiàn)：

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